همانند سازی

آزمایش مزلسون و استال :  آنها یاخته های باکتری E-Coli را در محیط کشت ویژه ای که نیتروژن آن از نوع سنگین (N15) بود، کشت دادند و سپس یاخته ها را به محیط کشتی که نیتروژن آن از نوع سبک (N14) بود، انتقال دادند. سپس از یاخته های نسل اول، دوم و سوم حاصل از محیط کشت جدید نمونه برداری کرده و DNA آنها را جدا کردند و بر روی گرادیان(شیب) چگالی کلرور منیزیم سانتریفوژ کردند. بدین ترتیب DNA دارای وزن های متفاوت از یکدیگر جدا می شوند.

DNA سبک که (N14) دارد به علت داشتن چگالی کمتر در بالای لوله قرار می گیرد ولی DNA سنگین (N15) به دلیل داشتن چگالی بیشتر پایینتر از DNA سبک قرار می گیرد. DNA دارای مقادیر متفاوت N14و N15 نیز در بین این دو جای می گیرند.

با کشت یاخته های دارای DNA سنگین در محیط کشت حاوی نیتروژن سبک مشاهده می شود که مولکول DNA ماهیت سبک- سنگین پیدا می کند یعنی دو رشته DNA از هم باز شده و رشته هایی در تکمیل هریک از دو رشته قبل ساخته می شود، این رشته ها همگی دارای نیتروژن سبک هستند. با ادامه کشت در نسل های دوم و سوم ملاحظه می شود که از میزان DNA سبک- سنگین کاسته شده و به DNA سبک افزوده می شود.

 نتیجه آزمایش مزلسون و استال :

زلسون و استال با چنین مشاهداتی نتیجه گرفتند که همانندسازی به طریق نیمه حفاظتی صورت می گیرد که مستلزم باز شدن دو رشته از هم و سنتز مولکول DNA جدید در مقابل هر رشته قدیم است. این پدیده به نام همانندسازی مشهور است.

ساختار  DNA : هر نکلئوتید از سه قسمت تشکیل شده است.

* یک قند پنج کربنی به نام دئوکسی ریبوز     * یک باز آلی نیتروژن دار     * گروه فسفات

سلول چه تک کروموزمی و یا چند کروموزمی باشد باید در هر تقسیم تمام ژنوم همانند سازی شود.

شروع همانند سازی :

رپلیکون : واحد DNA که در آن یک فرآیند همانند سازی منفرد رخ می دهد.

بعد از کامل شدن همانند سازی تقسیم رخ می دهد.

رپلیکون یک نقطه شروع دارد که در آن همانند سازی شروع میشود و ممکن است که یک نقطه پایان داشته باشد.

نقطه شروع یک محل عمل کننده  cis  است . که با پروتئین عمل کننده ترانس فعال می شود که این پروتئین ممکن است از جای دیگر کد شود.

• بین سازمان بندی ژنوم باکتری ها،آرکئاها و یوکاریوت ها از نظر همانندسازی تفاوت اساسی وجود دارد.
• باکتری های هاپلوئید یک کروموزم واحد دارد که این نوع کنترل همانندسازی را تک نسخه ای میگویند.
• برخی آرکئاهای مشابه با شرایط باکتری ها هستندو یک نقطه شروع دارند و برخی از چند جا نقطه شروع دارندکه چند رپلیکونی اند.
• بعضی از سیگنال ها باید رپلیکون های همانند سازی شده را از همانندسازی نشده متمایز کنند تا دوباره همانند سازی نشوند.

همانند سازی با جدا شدن دو رشته DNA دوپلکس از ناحیه ی مبدا آغاز میشود.

• همانند سازی نیمه حفاظت شده : بعد از همانند سازی یک دوپلکس والدی به دو دوپلکس دختری تبدیل میشود که هر کدام شامل یک رشته والدی و یک رشته جدید است.

حباب همانندسازی: DNAی همانند سازی شده به صورت حباب همانند سازی دیده می شود که توسط DNAی همانندسازی نشده احاطه گردیده است.

 چنگال همانندسازی : ناحیه ای که همانند سازی در حال انجام است گویند.

• همانند سازی یک طرفه است یا دو طرفه است.
• * در همانند سازی دو طرفه دو چنگال همانند سازی شکل می گیرد و از مبدا به دو سمت مخالف هم پیشروی می کند.
• * برای همانند سازی سه الگو مطرح است : الگوی حفاظتی، نیمه حفاظتی و پراکنده

* در الگوی حفاظتی از روی مارپیچ دو رشته ای DNA یک مولکول کامل DNA ساخته می شود.

• * در الگوی نیمه حفاظتی ، دو رشته از هم باز شده و در مقابل هریک از رشته ها رشته مکمل ساخته می شود.مانند الگوی واتسون و کریت.

* در الگوی پراکنده ابتدا مولکول DNA به قطعاتی تقسیم می شود و هریک از قطعات رشته مکمل خود را سنتز می کند.

** آنزیم های لازم در همانند سازی :

DNA پلی مرازها : DNA پلی مرازها افزودن نوکلیوتیدها طی طویل شدن زنجیره را کاتالیز می کند. این آنزیم ها برای عمل هم به الگوها((Template وهم به  پرایمرها(Primers) نیازمند هستند.

DNA پلی مرازهایی که در همانند سازی شرکت می کنند از دو طریق به تضمین دقت کمک می کنند:

1-    با انتخاب اولیه نوکلیوتید مناسب برای افزودن

2-    با تصحیح آ نزیمی

انتخاب اولیه بر اساس صحت نوکلیوتید تازه وارد به جایگاه فعال پلی مراز می باشد. یک نوکلیوتید تازه وارد که با نوکلیوتید موجود در رشته الگو، پیوند هیدروژنی صحیح برقرار می کند می تواند به زنجیره در حال رشد اضافه شود.

* تا کنون سه نوع آنزیم DNA پلی مراز به نام هایIII,II,I  شناخته شده اند:

* از بین آنها آنزیم DNA پلی مراز III نقش اصلی را در سنتز DNA دارد و از خصوصیات مهم آن، این است که منحصرا نوکلیوتیدها را در جهت 5´ به 3´ به هم متصل می کند و در جهت عکس نمی تواند عمل کند.

DNA پلی مراز II نیز در مرحله ای از سنتز DNA وارد شده و سنتز را در جهت 3´ به 5´ پیش می برد.

و آنزیم DNA پلی مراز I عمل ترمیم و همانند سازی را انجام می دهد.

 آنزیم های هلیکاز(Helicase)

جدا شدن دو رشته والد DNA از یکدیگر این امکان را فراهم می سازد تا هر رشته به عنوان الگو برای سنتز رشته جدید مورد استفاده قرار گیرد. جدا شدن دو رشته والد DNA باعث ایجاد ساختاری موسوم به چنگال همانند سازی می گردد. این جدا شدن نیازمند صرف انرژی قابل توجهی است بطوریکه تنها در دماهای بالا و معمولا بالاتر از 90°C رخ می دهد.که بنابراین سلول ها برای جداسازی رشته های والد در دماهای فیزیولوژیکی از آنزیم هایی به نام هلیکازها (Helicase) استفاده می کنند.

آنزیم های هلیکاز برای عملکرد در هر مرحله نیازمند هیدرولیز ATP هستند.

هلیکاز با هل دادن DNA والد، چنگال همانند سازی را می سازد.

  همانندسازی متوالی :

در روی مولکول DNA نقاطی وجود دارد که همانند سازی از آنها آغاز می شود. این نقاط مبدا همانند سازی نامیده می شوند. در DNA باکتری ها یک مبدا همانند سازی و در DNA موجودات عالی، تعداد زیادی از این مبدا وجود دارند.

هنگام همانند سازی ابتدا آنزیم هلیکاز به مارپیچ دو رشته ای DNA متصل شده و پیچش DNA را درآن نقطه باز می کند. پروتیین های DBP به ناحیه باز شده هجوم آوره و با اتصال به DNA تک رشته ای  مانع از جفت شدن بعدی DNA می شود. ناحیه ای را که هلیکاز به آن متصل می شود، چنگال همانند سازی می نامند.

همانند سازی به صورت دو سویه است و همانطور که گفته شد آنزیم پلی مرازIII که اتصال نوکلیوتیدها را به یکدیگر به عهده دارد فقط می تواند همانند سازی را در جهت 5´ به 3´ پیش ببرد.

 

 همانند سازی نا متوالی : رشته دیگر که از هم باز شده بودند در جهت 3 به 5 می باشند.و به همین دلیل آنزیم پلی مراز III نمی تواند نوکلیوتیدها را در جهت 3´ به 5´ کاتالیز کند. که به این رشته پیرو گفته می شود.

و به صورت قطعات ناپیوسته به نام قطعات اکازاکی در جهت 3َ → 5َ از منطقه ای جلوتر سنتز شده و بعداً به هم متصل می شوند تا رشته کامل را بوجود آورند.

در این حالت آنزیم پلی مراز I وارد عمل شده و به ترتیب یکی یکی ریبونوکلیوتید ها را در جهت  5´ به 3´ برداشته و بجای آنها نوکلیوتید های از انواع دزوکسی جایگزین می کند تا اینکه همه قطعات از نوع دزوکسی شوند. سپس انتهای  قطعات ساخته شده بوسیله آنزیم لیگاز به هم متصل شده و یک رشته ممتد DNA حاصل می شود.